納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是從日本傳統(tǒng)食品中分離出來的芽孢桿菌，其原始菌株與枯草芽孢桿菌相同，是枯草芽孢桿菌的一個亞種。納豆芽孢桿菌能產(chǎn)生具有溶纖活性的納豆激酶,其芽孢能耐酸堿、耐高溫(100℃)及耐擠壓，在飼料制粒過程及酸性胃環(huán)境中均能保持高度的穩(wěn)定性；在腸道中不增殖，只在腸道上段迅速發(fā)育轉(zhuǎn)變成代謝活躍的營養(yǎng)型細胞，增強以厭氧菌為優(yōu)勢菌群的腸道正常菌群的生長，促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強機體的免疫功能。體外試驗研究表明，添加納豆芽孢桿菌能使腸道酸化而有利于鐵、鈣及維生素D等的吸收，促進動物生長，縮短飼養(yǎng)周期，同時納豆芽孢桿菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能降解植物性飼料中某些復雜的碳水化合物，從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率并增加飼料的可利用種類。動物飼養(yǎng)試驗結果表明，在仔豬前、后期日糧中添加納豆芽孢桿菌能明顯提高仔豬生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率，經(jīng)濟效益顯著；日糧中添加適宜用量的納豆芽孢桿菌能提高雞十二指腸消化酶的活力，顯著提高肉仔雞生長性能。因此，納豆芽孢桿菌是一種較好的微生物飼料添加劑，目前在家畜及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用日益擴大。
由于納豆芽孢桿菌的芽孢較其營養(yǎng)體細胞易保藏，復活率高，是制備納豆芽孢桿菌制劑的理想存在形式。因此，獲得高濃度、高活性的芽孢是制備納豆芽孢桿菌制劑的關鍵。目前，國內(nèi)對納豆芽孢桿菌的研究大多集中于納豆固體培養(yǎng)、納豆激酶，液體深層培養(yǎng)研究也以收獲營養(yǎng)活菌體為目的，在其芽孢形成方面的研究不多。因此，本文旨在通過對影響納豆芽孢桿菌液體培養(yǎng)形成芽孢的營養(yǎng)條件、pH值、接種量、溶氧水平方面進行研究，為納豆芽孢桿菌芽孢制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
1 材料
1.1 微生物菌種
納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）JS-NDT-05，由江蘇省微生物研究所選育、分離純化和保藏。
1.2 試劑
乳糖、蔗糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、CHNO、玉米漿粉、酵母粉均為國產(chǎn)生化試劑；尿素、葡萄糖、NH4Cl、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、CaCO3為國產(chǎn)分析純試劑；玉米淀粉、小麥淀粉、木薯淀粉、紅薯淀粉、魚粉、大豆粉、大豆餅粉、花生餅粉均為市售。
1.3 培養(yǎng)基
1.3.1 斜面種子培養(yǎng)基
BPY培養(yǎng)基：CHNO5g/l、酵母膏5g/l、蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、NaCl 5g/l、瓊脂15～20g/l、蒸餾水1L，pH值7.2。
1.3.2 搖瓶培養(yǎng)基
根據(jù)試驗需要配制培養(yǎng)基或在基礎培養(yǎng)基中添加C源、N源或無機鹽配制培養(yǎng)基。C源基礎培養(yǎng)基: 酵母膏3g/l、蛋白胨10g/l、NaCl 5g/l，pH值7.2～7.4；N源基礎培養(yǎng)基: 葡萄糖5g/l、NaCl 5g/l，pH值7.2～7.4。
1.3.3 活菌及芽孢檢測用培養(yǎng)基
營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基。
1.4 器材
pH計(、HYG-11a迥旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜、自動發(fā)酵罐、721分光光度。
2 方法
2.1 培養(yǎng)方法
2.1.1 種子培養(yǎng)
用接種針從菌種斜面上沾取少量菌泥，劃線接種于BPY培養(yǎng)基，電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)18～24h，鏡檢以芽孢為主即成熟。
2.1.2 搖瓶培養(yǎng)
將成熟的種子用無菌水從斜面上刮洗下來，放入內(nèi)裝無菌玻璃珠的滅菌三角瓶中，振蕩，制成均勻的菌懸液，80℃水浴加熱10min，以2%(v/v)的接種量接入孢子懸液，搖瓶裝量10%～20%(v/v)，在37℃條件下，200～220r/min的迥搖培養(yǎng)20～48h。
2.1.3 15L自動發(fā)酵罐培養(yǎng)
發(fā)酵罐裝液量70％～80%(v/v)，將成熟的斜面種子菌懸液經(jīng)80℃水浴加熱10min后，接入15L自動發(fā)酵罐，電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h左右，攪拌轉(zhuǎn)速300～450r/min, 通氣量4.0L/min。培養(yǎng)過程中pH值、溶氧水平可根據(jù)實驗需要進行電腦自動控制和監(jiān)測。
2.2 測定方法
pH值測定用梅特勒-托利多Delta320pH 計測定；活菌總數(shù)計數(shù)采用周佳慶介紹的方法；芽孢平板計數(shù)是在80℃水浴加熱15 min后，采用平板菌落計數(shù)法檢測芽孢的生成量；芽孢染色法觀察芽孢；芽孢率是指樣品按活菌總數(shù)計數(shù)、芽孢平板計數(shù)分別計數(shù)活菌總數(shù)和芽孢數(shù)，計算公式為：
芽孢率（%）=（芽孢數(shù)/活菌總數(shù)）×100%。
3 結果與討論
3.1 C源對芽孢形成的影響
在培養(yǎng)基成分中，碳源及其濃度是影響芽孢形成的主要因素[12-15],在C源基礎培養(yǎng)基中分別添加不同C源，即：玉米淀粉20g/l、小麥淀粉20g/l、木薯淀粉20g/l、紅薯淀粉20g/l、乳糖5g/l、蔗糖5g/l、麥芽糖5g/l、葡萄糖5g/l，配制培養(yǎng)基，250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基50ml，進行納豆芽孢桿菌的搖瓶培養(yǎng)。
實驗結果表明：納豆芽孢桿菌JS-NDT-05具有良好的淀粉酶活性，能直接利用淀粉且生長良好。與葡萄糖、乳糖等*碳源相比較，在玉米淀粉、小麥淀粉等淀粉類長效碳源中，菌體生長較慢，14～16h時生長進入平衡期，比葡萄糖、乳糖等*碳源晚2～6h。在芽孢形成方面，淀粉類碳源的芽孢形成極緩慢，培養(yǎng)24h左右鏡檢，除木薯淀粉、紅薯淀粉培養(yǎng)基中有少數(shù)菌體開始形成芽孢外，玉米淀粉和小麥淀粉培養(yǎng)基中的菌體均呈營養(yǎng)體形態(tài)，未形成芽孢，延長培養(yǎng)時間至40h, 木薯淀粉、紅薯淀粉分別有93.5%、90%的菌體形成了芽孢，而玉米淀粉和小麥淀粉則不理想；而在葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖培養(yǎng)基中，菌體在10h左右生長進入平衡期后即開始形成芽孢，培養(yǎng)24h，除麥芽糖芽孢形成不理想外，葡萄糖、乳糖、蔗糖均已有90%以上的菌體形成了芽孢。從總體看來，玉米淀粉的營養(yǎng)菌體數(shù)量MAX多，但不利于芽孢形成；木薯淀粉芽孢形成數(shù)量MAX高，葡萄糖次之，兩者的芽孢形成率相近，但所需培養(yǎng)時間不同，木薯淀粉需40h，而葡萄糖只要24h。因此，葡萄糖對納豆芽孢桿菌的芽孢形成MAX適宜。
在C源基礎培養(yǎng)基中，以葡萄糖為C源，配制含不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基， 250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基25ml，進行搖瓶培養(yǎng)，考察葡萄糖濃度對納豆芽孢桿菌JS-NDT-05芽孢形成的影響。
實驗結果表明：隨著葡萄糖濃度的提高，活菌數(shù)和芽孢數(shù)都呈先升后降變化趨勢，芽孢形成率總體呈下降趨勢，在葡萄糖濃度達15g/l時，活菌數(shù)及芽孢數(shù)達峰值。當葡萄糖濃度在0～15g/l范圍內(nèi)變化時，芽孢形成率變化不大，均在97%以上，說明提高葡萄糖濃度能提高芽孢濃度。當葡萄糖濃度超過15g/l時，不僅芽孢形成率明顯下降，而且活菌數(shù)和芽孢數(shù)也下降至葡萄糖濃度為5g/l時的水平。這可能是由于菌體利用葡萄糖生長時，產(chǎn)生酸性代謝物，葡萄糖濃度越高，生長對數(shù)期的pH值就越低，起始葡萄糖濃度超過15g/l后，生長對數(shù)期pH值均低于5，菌體代謝改變，生長和芽孢形成受抑制。因此，為了在提高菌體濃度的同時，維持較高的芽孢形成率，提高MAX終收獲的芽孢數(shù)，必須控制葡萄糖濃度，葡萄糖的起始濃度控制在15g/l，對芽孢形成MAX適宜。
3.2 N源對芽孢形成的影響
培養(yǎng)基中氮源也影響芽孢的形成[13]。在N源基礎培養(yǎng)基中分別添加有機氮源，如蛋白胨、酵母膏、玉米漿粉、大豆粉、大豆餅粉、花生餅粉、魚粉和酵母粉各10g/l及無機氮源，如尿素、NH4Cl和（NH4）2SO4各20g/l，配制培養(yǎng)基，250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基25ml ，進行搖瓶培養(yǎng)，考察不同N源對納豆芽孢桿菌JS-NDT-05芽孢形成的影響。
實驗結果表明：納豆芽孢桿菌 JS-NDT-05的生長有機氮源適宜，在以無機氮為氮源時，生長弱，芽孢難以形成，此結果與陳麗花等[16]的部分研究結果相同。在有機氮源中除酵母粉外，芽孢形成率均能達98%以上，芽孢數(shù)量從高到低依次為酵母膏、蛋白胨、玉米漿粉、花生餅粉、大豆餅粉、魚粉、大豆粉。玉米漿粉、花生餅粉、大豆餅粉為工業(yè)副產(chǎn)物，價格較低廉，是低成本工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)芽孢的優(yōu)選N源。因此，以下實驗中的N源均采用大豆餅粉。
3.3 無機鹽
在納豆芽孢桿菌液體深層培養(yǎng)時，培養(yǎng)基組成中以NaCl為無機鹽，獲得的菌體量高，為了在提高活菌數(shù)的同時，提高芽孢數(shù)量，以葡萄糖5g/l、大豆餅粉10g/l、NaCl 5g/l為對照，再分別添加無機鹽：CaCO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4各3g/l；KH2PO4 1g/l+K2HPO4 3g/l，配制培養(yǎng)基，250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基25ml ，進行搖瓶培養(yǎng)23h，考察不同無機鹽對納豆芽孢桿菌 JS-NDT-05芽孢形成的影響。
實驗結果表明：添加CaCO3，芽孢形成率高，但不利于活菌數(shù)量和芽孢數(shù)量的提高； MgSO4·7H2O利于菌體的生長，但不利于芽孢形成，芽孢形成率較低；分別添加KH2PO4和K2HPO4，對菌體生長和芽孢形成情況與NaCl相似，但同時添加則促進菌體生長，顯著提高活菌數(shù)，但強烈抑制芽孢的形成。由于添加KH2PO4后活菌數(shù)、芽孢數(shù)量和芽孢形成率均有所提高，因此，后續(xù)實驗用培養(yǎng)基中無機鹽除NaCl外，添加KH2PO4。
Mn作為一種微生物生長所需的微量元素，是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖異構酶等許多酶的輔助因子，對活菌數(shù)和芽孢形成有影響。因此，按上述實驗獲得的MAX適C源、N源及無機鹽組成配制培養(yǎng)基，即葡萄糖15g/l、大豆餅粉10g/l、KH2PO4 3g/l、NaCl 5g/l，添加不同濃度的MnSO4·H2O使Mn2+濃度分別為:0、1.2、2.4、3.5、4.7、5.9、7.1mmol/l，考察Mn2+濃度對芽孢形成的影響。
實驗結果表明:Mn2+對菌體生長有促進作用，營養(yǎng)菌體數(shù)量和芽孢數(shù)量隨著Mn2+濃度的提高而提高，但芽孢形成率則在Mn2+濃度為1.2～2.4mmol/l(即MnSO4· H2O 0.2～0.4g/l)時達98%以上，隨后呈下降趨勢，當Mn2+濃度達7.1mmol/l時對芽孢的形成產(chǎn)生顯著抑制。因此, 在獲得較高菌體量同時,還要求保持理想的芽孢形成率,則Mn2+濃度為2.4mmol/l(即MnSO4·H2O 0.4g/l)時MAX適宜。
3.4 pH值對芽孢形成的影響
如前述以MAX適C源、N源及無機鹽配制培養(yǎng)基，接種前用無菌NaOH或HCl調(diào)整起始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基25ml，進行搖瓶培養(yǎng)，考察起始pH值對Bacillus natto JS-NDT-05芽孢形成的影響。
實驗結果表明:從菌體生長數(shù)量來看，起始pH值7～7.5MAX適宜，但對芽孢形成率來說，起始pH值6.5～7.0MAX適宜，因此，pH值7.0是MAX適宜的起始pH值。
3.5 接種量對芽孢形成的影響
250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基25ml，接種Bacillus natto JS-NDT-05芽孢，使搖瓶中芽孢數(shù)量分別為104、105、106、107數(shù)量級，進行搖瓶培養(yǎng)24h，考察接種量對芽孢形成的影響。
實驗結果表明：收獲的芽孢數(shù)量隨著接種量的提高而提高，低接種量表現(xiàn)出很高的孢子增長倍率,但不能夠獲得較高的芽孢數(shù)量,MAX高接種量能收獲MAX大孢子數(shù)量，但孢子增長倍率MAX低,因此，控制芽孢接種量，起始使芽孢濃度在106個/ml數(shù)量級MAX適宜。
3.6 溶氧水平對芽孢形成的影響
氧氣是影響芽孢形成的一個重要因素，不同的菌株形成芽孢所需的供氧條件不同。Mohamed Ismall等研究過球形芽孢桿菌溶解氧與芽孢形成的關系，發(fā)現(xiàn)隨著溶解氧濃度升高，芽孢形成率也越高，但有的學者卻得出了相反的結論。為了考察溶氧對納豆芽孢桿菌JS-NDT-05芽孢形成的影響，在250ml三角瓶中分別裝培養(yǎng)基25ml、50ml，進行搖瓶培養(yǎng)24h。
實驗結果表明:通氣量大（通氣時間長），溶氧水平高，有利于菌體的生長、芽孢的形成和后期芽孢活性的保持。比較搖瓶裝量25/250ml和50/250ml，在菌體生長前期，兩者相似，進入對數(shù)生長期后，供氧對菌體生長影響顯著，通氣量大的25/250ml裝量菌體生長快，活菌數(shù)量高，芽孢形成早，芽孢數(shù)量高，而供氧水平低的50/250ml裝量菌體生長慢，平衡期短，菌體易衰老，芽孢形成率MAX高僅為80%左右且芽孢極易失活。由于搖瓶培養(yǎng)不便于監(jiān)測培養(yǎng)基中的溶氧變化，因此,在15L自動發(fā)酵罐中分別進行不控制溶氧水平、用攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧水平不低于30%的實驗，對培養(yǎng)過程進行觀察,進一步考察溶氧對菌體生長和芽孢形成的影響。
觀察比較不控制溶氧水平和控制溶氧水平兩個培養(yǎng)過程，可以看出：菌體進入對數(shù)生長期后,快速消耗氧氣，若不通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速或通氣量進行溶氧水平的調(diào)控，則培養(yǎng)基中溶氧水平可降至0%，時間長達4h，此時菌體處于厭氧生長，菌體生長減緩，而在控制溶氧水平的罐批中菌體的生長不受影響，生長速度快，生長量高，9h左右就已結束對數(shù)生長期，進入平衡期。從對數(shù)生長中后期開始,菌體生長減緩，耗氧減少，溶氧逐步回升。在芽孢形成方面,在以芽孢方式接種后，由于芽孢萌發(fā)，兩個罐批的芽孢率均急劇下降，當菌體結束遲滯期時芽孢率幾乎降至為0%，在平衡期的中后期，菌體開始形成芽孢。由于控制溶氧水平的罐批，菌體生長快，生長量多，芽孢形成也快，且芽孢數(shù)量也多，20h芽孢數(shù)可達7.7×109個/ml。就MAX終芽孢形成率來說,兩個罐批的結果相似,均在98%以上。
4 小結
芽孢是產(chǎn)芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，并非細菌生活史*的部分,它的形成受營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的影響。本文考察了營養(yǎng)條件、pH值、接種量、溶氧水平方面對納豆芽孢桿菌JS-NDT-05液體培養(yǎng)形成芽孢的影響。在營養(yǎng)條件方面,納豆芽孢桿菌JS-NDT-05具有淀粉酶活性,能直接利用淀粉類C源,且與葡萄糖、蔗糖等*碳源在菌體生長方面相似,但芽孢形成緩慢。玉米淀粉MAX適宜菌體生長，能提高營養(yǎng)活菌的數(shù)量,但不利于芽孢形成。就芽孢形成來說,木薯淀粉和葡萄糖的芽孢形成率相近,前者芽孢收獲量略高,但培養(yǎng)時間約是后者的2倍。因此,兼顧芽孢量的收獲和培養(yǎng)時間的縮短,葡萄糖是MAX適宜的C源。葡萄糖濃度對菌體生長和芽孢形成有影響,濃度低時,提高葡萄糖濃度能提高菌體量,芽孢形成幾乎不受影響,過高的葡萄糖濃度抑制菌體的生長,降低芽孢形成率,因此,培養(yǎng)基MAX適宜的起始葡萄糖濃度為15g/l。
納豆芽孢桿菌JS-NDT-05適宜有機氮源，芽孢形成率除酵母粉外均能達到98%。以無機氮為氮源時, 納豆芽孢桿菌生長弱，芽孢難以形成；以酵母膏為氮源時,芽孢數(shù)量MAX高,但從利用廉價工業(yè)副產(chǎn)品的角度，玉米漿粉、花生餅粉、大豆餅粉應是低成本、大規(guī)模培養(yǎng)芽孢的適宜氮源。NaCl是適宜菌體生長的無機鹽, CaCO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4分別與之組成培養(yǎng)基的無機鹽組分時,對菌體生長和芽孢形成的影響不同, 添加KH2PO4后,活菌數(shù)、芽孢數(shù)量和芽孢形成率均有所提高。Mn2+促進菌體生長，隨著Mn2+的提高，納豆芽孢桿菌的營養(yǎng)活菌數(shù)隨之提高，但對芽孢形成來說,低濃度Mn2+不影響芽孢形成率，當濃度超過7.1mmol/l時則顯著抑制芽孢形成，Mn2+濃度為2.4mmol/l時對芽孢形成率和活菌數(shù)均有利。
對于培養(yǎng)基的起始pH值來說,在6.0～8.5的考察范圍內(nèi)，菌體生長和芽孢形成對pH值的要求有所不同，7.0～7.5是適宜生長的pH值范圍，6.5～7.0則是適宜芽孢形成的pH范圍。因此，為了在提高菌體量的同時提高芽孢數(shù)量，pH值7.0MAX適宜。在接種后起始芽孢數(shù)104～107個/ml的實驗考察范圍內(nèi),接種量的提高有利于芽孢數(shù)量的提高,但接種后芽孢的倍增率則下降了，芽孢接種量在106數(shù)量級可取得穩(wěn)定的平衡。
納豆芽孢桿菌是好氧菌,溶氧是菌體生長和芽孢形成的重要因素。搖瓶實驗結果顯示,通氣量大有利于菌體生長,提高芽孢形成率,有利于芽孢活性的保持。在15L自動發(fā)酵罐中對培養(yǎng)過程進行觀察,結果顯示,在對數(shù)生長期菌體快速生長,供氧速度跟不上耗氧速度,導致菌體處于厭氧生長狀態(tài),不僅減緩了生長速度，延后芽孢的形成,而且也不利于活菌數(shù)和芽孢數(shù)量的提高，在培養(yǎng)過程中,控制溶氧水平,則能顯著改善這一狀況,提高芽孢收獲量,縮短培養(yǎng)時間。
